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【随笔】有关 PCR 的一切

Zt
2021-03-07
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03/07

有关 PCR 技术的一切

前言

在阅读本篇文章之前,需要掌握一些有关 DNA 的基础知识,比如 DNA 的结构、复制过程等。DNA 的复制遵循以下几个规则。

  • 半保留复制。DNA 双链复制前需先解旋,解旋后的两条链作模板链,分别产生两条子链。
  • 复制需要引物。DNA 聚合酶需要引物的引导才能开始将单个脱氧核糖核苷酸连接到子链上,没有引物,复制就无法开始,不论是 PCR 还是体内的 DNA 复制,都是这样。就像一个人,他会唱歌,但是不会起头,必须要有一个人给他起个头,他才能接着唱下去。
  • 复制方向为子链的 5' 端到 3' 端。DNA 复制方向沿着模板链的 3' 端到 5' 端进行复制,即子链的 5' 端到 3' 端,这是因为 DNA 聚合酶得从引物的 3' 端开始拼接单个脱氧核糖核苷酸。

正文

一、简介

PCR 全称为 Polymerase chain reaction,译作聚合酶链式反应。这是一种可以从少量初始样品中扩增出大量目标 DNA 片段的技术,广泛用于病原体或病毒检测(如新冠病毒核酸检测所用的荧光 PCR 法,该方法详细见下文)、个体识别以及很多涉及 DNA 的科学实验。

二、PCR 流程

二、1.准备工作

  • 提取样本 DNA 或将 RNA 逆转录为 DNA(如新冠病毒核酸检测,详细见下文)
  • Taq DNA 聚合酶(热稳定 DNA 聚合酶)
  • 引物(实质为一段 DNA 或 RNA 单链片段)
  • 脱氧核糖核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)
  • PCR 仪器

二、2.变性

模板 DNA 经加热至 95℃ 左右一定时间后,使模板 DNA 双链解旋,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。

二、2.退火(复性)

模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55℃ 左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。

二、3.延伸

DNA 模板引物结合物在 72℃、DNA 聚合酶(如 Taq DNA 聚合酶)的作用下,以脱氧核糖核苷酸为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。

二、4.循环

一般循环 30-40 次就可以得到上千万条目标 DNA,但至少循环 3 次得到完整目标 DNA 链,为什么呢?

第一次循环

这是一条 DNA 双链,我们要对目标基因进行扩增。

第一次高温变性后,DNA 双链解旋为两条 DNA 单链。(P 链)

20-30s 后,温度降低至 55℃ 左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。引物不可能刚好和 DNA 链的开头相结合,一般都是在偏 5' 端的位置与 DNA 链结合。

20-40s 后,温度升高至 72℃ 左右,DNA 聚合酶从新链的 5' 端开始,将游离的脱氧核糖核苷酸按照碱基互补配对原理,合成第一条 DNA 单链(F1 链)

至此,第一次循环结束,经过复制得到了两条含有 DNA 子代链的 DNA 双链,也就是两条 P-F1 链,进入下一次循环。

第二次循环

再次加热,第一次循环得到的 2 条 DNA 双链受热解旋,成为 4 条 DNA 单链:P P F1 F1

降温,引物结合。这次引物将会分别结合在 P 链和 F1 链上,同样均不可能结合在链的开头。

升温至 72℃,DNA 聚合酶开始合成第二条 DNA 单链(F2 链)。在 F2 链合成完成后,可以注意到,经过两次配对后,所合成的 F2 链的 3' 端和 5' 端都已经成为了和引物一样或互补的基因序列了,都可以直接和引物配对结合了。(图中红色区域)

经过第二次循环,我们得到了 4 条 DNA 双链:P-F1 P-F1 F1-F2 F1-F2,这 4 条双链均进入下一轮循环。

第三次循环

再次加热,第二次循环得到的 4 条 DNA 双链受热解旋,成为 8 条 DNA 单链:P P F1 F1 F1 F1 F2 F2

降温,引物结合。这次引物将会分别结合在 P 链、F1 链和 F2 链上。在第二次循环中说到,F2 链的 3' 端和 5' 端都已经可以直接和引物配对结合了,所以这里引物直接和 F2 链的 3' 端结合。

于是,经过至少 3 次循环,我们就得到了完整的目标 DNA,并且这之后,目标 DNA 将开始迅速扩增,呈[指数级增长],而非目标 DNA 则是呈[线性增长]。并且还可以知道引物的选取,实际上应该和目标 DNA 片段的靠近 3' 端的一段和靠近 5' 端的一段保持一致或互补

三、PCR 有关的计算

三、1.至少需要加入的引物的数量

由引物的数量 = 每次复制新增的链的数量 = $2^n$(设循环 n 次)

根据等比数列求和公式($\frac {a_1 \cdot (1-q^n)}{1-q}$)得循环 n 次至少所需引物数量为 $2^{n+1} - 2$ 个

三、2.目标 DNA 数量占总数的多少

总 DNA 数量就是 DNA 复制的计算公式,即循环 n 次时,DNA 总数为 $2^n$ 个

而目标 DNA 数量 = DNA 总数 - 含 F1 链的 DNA 数量 - 含 P 链的 DNA 数量

F1 链的 DNA 数量为 $2(n-1)$,如果要直接推出规律其实也不难,但是多列出几个循环,然后找数字之间的规律更简单而有效。如,循环 n 次时,含 F1 链的 DNA 数量列一个表为:

循环次数/n1234...
F1 链条数/条0246...

so 很容易就可以得到含 F1 链的条数的通项公式为 $2(n-1)$

而含 P 链的 DNA 条数永远为 2 条

所以得到目标 DNA 数量 =$2^n-2(n-1)-2$ = $2^n-2n$

占 DNA 总数的$\frac {2^n-2n}{2^n}$

四、实时荧光定量 PCR 技术(TaqMan 探针法)

四、1.简介

实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR/qPCR)指的是在 PCR 进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。这是 PCR 技术实际应用中的一个,检测新冠病毒阳性/阴性使用的就是这个方法。在了解 PCR 之后,再来看这个技术的应用就简单许多了。本篇以下的流程均以新冠病毒检测为例介绍该技术。

这是一份新冠病毒检测试剂盒所包含的东西:

四、2.具体流程

Step1:提取样品
Step2:反转录

由于新冠病毒为 RNA 病毒,而 PCR 技术是适用于 DNA 的,所以先要使用反转录酶,制造出互补的 cDNA 单链。

Step3:复制单链

接下来将反转录得到的 cDNA 单链通过 DNA 聚合酶转为 cDNA 双链,以便接下来进行 PCR

Step4:高温解旋

这一步和 PCR 技术一样,不再赘述。

Step5:低温复性

这一步和 PCR 不同的地方在于,这里加入了 TaqMan 探针,这是一段两端有特殊基团的脱氧核糖核苷酸序列。和引物一样,它可以识别 DNA 链上的特殊序列并结合。

TaqMan 探针 5' 和 3' 两端的基团分别为荧光基团和猝灭基团,荧光基团能被特殊波长的光照射后表现出荧光。而猝灭基团则能在和荧光基团距离较近时,抑制荧光基团的发光。

Step6:中温延伸

和 PCR 一样,恢复到中温以后,由 DNA 聚合酶从引物 3' 端开始,将单个游离的脱氧核糖核苷酸遵守碱基互补配对原则拼接成为一个新的 DNA 链。

当 DNA 聚合酶拼接到 TaqMan 探针的 5' 末端和 3' 末端时,DNA 聚合酶中含有的 5' 外切酶会把两个特殊的基团剪切下来,使得荧光基团和猝灭基团游离,使得样品发光

进行 30 分钟左右的 PCR 扩增后,就可以通过特殊仪器检测到样品中的荧光量,从而检测样品是否为阳性。因为如果不含有目标基因,TaqMan 探针两端的荧光基团和猝灭基团就不会游离,这时两基团相距较近,猝灭基团抑制荧光基团发光。而如果存在目标基因,则会使得两基团游离,猝灭基团不再抑制荧光基团的发光,使得样品“blingbling”的。

如果检测到大量荧光,则样品为阳性,如没有,则为阴性。

这样一台 PCR 检测仪器一次性可以检测 384 份样品,这使得核酸检测成为了检测新冠病毒感染者最快最有效的方式。

写在最后

本篇部分图片来自互联网,如有侵权,请通过博客下方链接及时联系我。如发现本文的错误,同样欢迎通过博客下方链接联系我说明。

写这篇文章的主要目的是简单介绍 PCR 技术,最主要的目的还是因为她想听。❤~:)

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